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导电低聚糖(聚乙二醇)富马酸聚吡咯神经再生水凝胶的研制
梅奥医学院整形外科，生物医学工程和神经科学系医学，第一大街200号西南，MS 3-69，明尼苏达55905，罗切斯特，中央研究爱荷华大学，艾奥瓦城，52243。
导电水凝胶复合材料的研究是低聚糖(聚乙二醇)富马酸酯(OPF)和聚吡咯(聚吡咯)在神经再生中的开发应用。OPF聚吡咯支架的合成使用了三种不同的阴离子：萘二磺酸钠（NSA）、十二烷基苯磺酸钠盐（DBSA），和丁二酸二异辛酯磺酸钠（DOSS）的酸根离子。其表征的完成有ATR-FTIR支架，XPS，原子力显微镜，动态力学分析，电阻率测量，膨胀实验等。OPF-聚吡咯 支架被证明由从265~323 kPa抗压模量的25ml%聚吡咯和6~30times;103欧姆/平方的薄层电阻组成。
引言
脊髓的残疾和周围神经的频繁损伤导致再生受损神经的发展迅速。治疗节段性神经损伤的黄金标准是采用了自体移植的方式，虽然他们在一些方面受到了限制，包括获得必须足够的长度和必要大小的供体神经和错位复杂的神经解剖，包括神经的这些限制经常阻止完全功能的组合 从一个节段神经损伤恢复。因此，合成材料提供了一个有吸引力的替代疗法。合成支架可以设计所需的尺寸，机械性能和降解概况。通过技术将刺激物植入聚合物支架以刺激神经再生，这个领域的研究变得越来越重要；刺激包括拓扑，生物，化学或电气。
因为在过去的十年的研究显示，间歇性电刺激在试管和神经再生方面增加了轴突和轴突的延长，电刺激已得到越来越多的关注；然而，导电材料在生物材料领域的发展仍然有限，由于其机械性能差，变形性差，难以加工成复杂的三维结构。对于聚吡咯，我们最广泛的研究了导电聚合物在神经导管的应用，缺乏强大的生物材料应用程序所需的机械性能。这一事实驱动了混合材料的发展，利用大量聚合物具有所需的物理散装组合物的材料特性。导电聚合物是一种微量组分并添加导电性能产生的材料。。最近许多不同的聚吡咯复合材料开发专门为神经再生的应用程序。这些包括复合材料大部分聚合物由聚己内酯、聚（乳酸-乙醇酸），聚（alpha;-氰基丙烯酸乙酯），壳聚糖，或聚（ε-己内酯富马酸）。奎斯利艾利报导强调了一项评估领域的最新进展导电水凝胶复合材料。还存在23个其它的潜在方法利用率其生物材料的导电属性，包括导电纳米粒子和碳纳米管的使用；然而，他们的性质却与其生物毒性密切相关。
最近，我们报道的合成和制造复合材料组成的聚已酸内酯延胡索酸酯(PCLF)和聚吡咯(聚吡咯)。这些材料PCLF和聚吡咯的互穿网络都是为了保持PCLF的物理性能而加入的聚吡咯导电支架。在这项工作中，我们这种方法扩展到低聚糖(聚乙二醇延胡索酸酯)(OPF)水凝胶。OPF水凝胶的合成反应的氯化盐、聚乙二醇，由此产生的OPF可以通过自由基聚合的反丁烯基与整个OPF链交联。交联的OPF水凝胶，它不溶于水，允许聚合聚吡咯在其网络内通过自由基引发。化学合成
法合成的OPF聚吡咯材料不同于以往用水凝胶聚合技术合成的聚吡咯复合材料。贾斯廷等人最近的一个例子。通过聚吡咯电化学（羟甲基丙烯酸酯）法合成了水凝胶。得到的材料电阻从5-137千欧姆不等，取决于聚吡咯氧化或还原的状态。许多以前的例子水凝胶膜复合材料生物传感器和假体神经应用程序开发，由此产生的OPF聚吡咯材料在本研究的预期用途是作为神经导管。因此，在当做生物传感器和神经修复设备的情况下，这些材料需要一个比薄的水凝胶涂层更大尺寸的电极。另外，高分子神经导管内缺乏一个可以聚合吡咯的电极管道。因此，聚吡咯的化学合成是非常适合用于生产导电神经导管的研究方法。事实上，其他的例子使用聚（乳酸-乙醇酸）、壳聚糖、聚己内酯富马酸高分子神经导管也是用化学合成聚吡咯的方法合成出来的。
聚吡咯的合成需要包含（三种）阴离子，其阴离子稳定积极的一面电荷从而形成导电聚吡咯。这个三阴离子用于聚吡咯的合成包括萘磺酸根离子、十二烷基苯磺酸根离子，和辛磺基琥珀酸酯根离子。之所以选择这些阴离子，因为由此产生的 聚吡咯材料通常具有高导电率，并且之前生物材料应用的研究表明它们是兼容的。
在OPF聚吡咯复合材料中OPF水凝胶是一种可生物降解的水凝胶，是光或化学交联的可调材料通过聚合物的合成和交联制备的。水凝胶是重要的生物材料，因为它们包含了超过80%的水，因此拥有非常相似的生理环境使得营养和废物可以同时扩散进入或退出再生部位。OPF先前已被研究了多种软骨组织工程从药对神经再生方向研究，现已扩大到包括导电聚吡咯复合材料的研究。由此产生的OPF聚吡咯复合材料是第一批导电聚吡咯复合水凝胶作用的神经导管。
材料与方法
材料：所有材料均购自西格玛或费舍尔和使用，除非另有说明。
寡聚（聚乙二醇）富马酸酯支架的制备：寡聚（聚乙二醇）富马酸（OPF）合成如前所报导。OPF（1克）、乙烯基吡咯烷酮（300micro;L）和蒸馏水（950micro;L）被加热，轻轻搅拌。用光引发剂（750micro;l 6mg·mL-1）被添加到OPF溶液和涡旋确保均匀。该溶液被浇注到具由聚四氟乙烯间隔物分离形成膜厚度为0.5毫米的玻璃模中。OPF被辐照交联与紫外线(lambda;)315 - 380 nm)OPF水凝胶1 h。OPF水凝胶浸没在水中过夜，除去残留的杂质，然后真空干燥。链接的OPF的磁盘使用软木镗床打孔从膜直径为5毫米。
低聚（聚乙二醇）富马酸聚吡咯复合材料的合成：将OPF磁盘淹没在过氧化苯甲酰（2克，8毫摩尔）溶液中，在10毫升的二氯甲烷溶液中混合下静置5分钟，然后在真空下干燥，以除去二氯甲烷，留下过氧化苯甲酰堵塞在OPF磁盘。将吡咯溶液（0.4 M）和十二烷基苯磺酸钠（DBSA；0.09米）冷却至0°C.摩尔当量的DBSA用于其他OPF聚吡咯材料（含有磺基琥珀酸二辛酯钠盐）的合成（DOSS）或萘-2-磺酸钠盐的合成（NSA）。OPF磁盘淹没在水的吡咯溶液中搅拌12小时。然后将所得的黑色膜从水溶液中除去，用水冲洗，并在在二氯甲烷中溶胀三倍，然后用丙酮冲洗两次除去残留的杂质。随后将所得的复合膜干燥。在这篇文章中，支架简称OPF聚吡咯材料，对材料的一般特性和OPF作为讨论特定的聚合物样品。
X射线光电子能谱（XPS）。表面元素OPF聚吡咯的组合物，其特征在于在一个自定义设计的奎托斯轴超XPS系统。仪器的完整描述：装备表面分析室用单色1486.6 eV Kr源和具有500毫米铝的罗兰圆硅单晶单色器。典型的x射线枪设置15马发射电流加速电压15千伏。低能量的电子被用于补偿中和的样品；；使用下面的调查收集扫描仪器参数：能量扫描范围1200-5eV，传递能量160 eV，步长为1eV；停留时间200毫秒；和x射线大小为700times;300micro;m。高分辨率光谱中获得感兴趣的区域使用下面的实验参数:20-40eV能量窗；通过能源20eV；步长0.1eV；停留时间1000ms绝对能量刻度校准铜2p2/3峰值932.6 eV使用蚀刻铜的结合能盘子里。磁透镜，安装以上样本，结合静电透镜，用于集中分散的电子束表面。半球形部门分析仪(HSA)是用于分析电子的动能并延迟线探测器测量的电子计数。
所有光谱校准使用外源碳1 s峰值为285.0 eV。Shirley-type背景是减去从每个光谱占非弹性散射电子有助于更开阔的视野。商用Casa XPS软件被用来处理XPS数据。50传播修正相对灵敏度因子(RSF)值在奎托斯库中是用于基本量化，作为实现Casa XPS。山峰的组件包含一个高斯/洛伦兹产品30%的洛伦兹和70%的高斯的成分。一个错误报告(0.2 eV的结合能达到顶峰）。
衰减全反射傅里叶变换红外光谱学(ATR-FTIR)。干式OPF的化学成分和OPF聚吡咯复合材料在Nicolet进行了表征8700 FTIR光谱仪。所有光谱收集使用ATR锗晶体的决议4-1cm在1000-1cm用最低的64扫描。溶胀测量；OPF和OPF聚吡咯磁盘真空干燥后制造。干燥后的支架进行称重（WD）然后浸没在蒸馏水中24小时，使水凝胶的平衡。体重(Ws)。溶胀比率计算式：(Ws-Wd)/ Wd，Ws是溶胀后重量和Wd是干重。
原子力显微镜（AFM）。原子力显微镜图像使用一个庇护研究MFP - 3D仪器拍摄。nsc15阿尔布斯悬臂从一个典型的315千赫和40 N / m的典型的力被用于实验，在所有实验中使用恒定的谐振频率。样品用环氧树脂固定在玻璃滑道上。图片被收购在空气中使用交流（AC）方法。
表面电阻率。OPF-聚吡咯复合材料的表面电阻率测量通过将两个0.2毫米铂金电极水化水凝胶膜，用Fluke万用表测量。薄层电阻的计算方程式Rs=Rtimes;W / L，Rs是薄层电阻，R是测量电阻，W是样品的宽度，L为电极间的长度。
压缩模量。水凝胶被铸造成薄片，随后在蒸馏水中溶胀24小时，之后压缩测试。磁盘的6.0times;2.0毫米(直径times;厚度)穿孔从肿膜和多余的水从表面涂抹干燥。样品在TA仪器DMA 2980压缩模式下进行了测试。力的增加的速度在0-18N，2N是最低，预加载力为0.2 N的抗压模量确定的线性部分应力与应变曲线应变为10-20%。
OPF聚吡咯复合材料的细胞毒性。PC12细胞（ATCC）接种在12孔板的密度为24小时之前的20000细胞的水凝胶。PC12细胞保持在杜尔贝科改良的Eagle培养基（DMEM）补充有10%马血清，5%胎牛血清，0.5%链霉素和青霉素。有8micro;m含水凝胶网格尺寸Transwell板被放置在与水凝胶完全淹没在媒体的威尔斯。后1，3，7天，含水凝胶Transwell板被拆除，利用MTS法量化细胞数量（盒96，Promega公司，麦迪逊，WI）按照制造商的指示。
PC12细胞对OPF聚吡咯材料的附着。OPF聚吡咯复合材料制成的磁盘直径为1.1厘米，放置在一个24孔板上。支架在70%乙醇消毒30分钟，然后用无菌PBS冲洗几次。蒸压医疗级硅管插入到威尔斯限制的直径为0.95厘米表面积为0.71平方厘米的水凝胶磁盘。该磁盘充满了培养基，培养12小时，以除去任何剩余的杂质。PC12细胞接种在表面密度30000细胞CM-2上。实验与神经生长因子（NGF）在浓度为50ng·mL的介质中进行补充。MTS法测定细胞存活率（Promega）：细胞首先加入1毫升胰蛋白酶消化，然后加入吸气的胰蛋白酶，随后在37°C孵育10 min，用刮刀轻轻移出细胞与细胞表面转移到0.5毫升的介质中。这一步是至关重要的，以消除任何聚吡咯材料转移至聚吡咯干扰MTS分析。然后加入0.1毫升的MTS的磁盘井（含有转移细胞和轻轻混合）。细胞在37°C孵育2 h，将100micro;转移到96孔板中。在490纳米分子器件spectramax读板上测定吸光度。
PC12细胞形态。与PC12细胞的水凝胶磁盘固定 2%甲醛固定25 min，然后用PBS洗三次。细胞穿透0.1%Triton100X 3 min，然后在10%马血清的PBS孵育1h，细胞用1%铑环肽在5%马血清的PBS中染色1小时，然后用PBS洗三次。盘与安装在玻璃盖玻片的DAPI染色。样品上的LSM510倒置共聚焦显微镜成像，并在激发波长为368和488 nm的成像。一共分析了300细胞突起延伸使用NIH图像J， 只有突起，5micro;米或更长的时间进行计数。
统计分析。实验有三份的标本和结果报告作为标准偏差。单因素方差分析（ANOVA）进行了统计学意义的（statview，版本5.0.1.0，SAS研究所，公司，卡里，NC）评估结果。当全球检验呈阳性在0.05的水平，Bonferroni法多作比较检验，确定实验组之间的差异。
结果
图1显示了OPF和聚吡咯以及DBSA，和DOSS在这项研究中使用的掺杂剂。OPF聚吡咯材料的合成首先制造交联水凝胶支架组成的OPF。这些支架可以制作成复杂的结构与各种尺寸，通过注射成型，然后通过光交联后，UV曝光。OPF可以是光或化学交联，然而，光交联产生更一致的结果，因为能够形成均匀的混合物，在注射前部分交联，并完全交联后，UV曝光。
第一聚合交联OPF是吡咯在淹没OPF支架后再在过氧苯甲酰溶于二氯甲烷溶液的方案。在这一步骤中，过氧化苯甲酰和引发剂聚合吡咯，扩散到OPF支架，因为它在二氯甲烷溶液溶胀膨胀。过二氯甲烷，然后在真空下蒸发，留下过氧化苯甲酰堵塞的OPF支架内。这些OPF支架加载与过氧化苯甲酰，然后淹没在吡咯和阴离子的水溶液中。在这一步骤中，吡咯和掺杂剂扩散到OPF支架的水凝胶在水中溶胀膨胀。然而，过氧化苯甲酰不扩散，但仍然在支架，因为它不溶于水。因此，吡咯并未扩散到潮流，它是由opf聚吡咯复合材料快速聚合过氧化苯甲酰引发的。这些复合材料主要由OPF组成。这种方法克服了许多相关的单独使用聚吡咯合成和生物的难题和挑战，包括处理困难，力学性能差，和困难的生物降解性。
因为OPF-聚吡咯复合材料合成聚吡咯之前交联,最后描述OPF-聚吡咯支架依赖ATR-FTIR,XPS,AFM。聚合吡咯的消息后,公司的聚吡咯视觉效果明显。OPF支架从白到黑的聚吡咯和导电特征。首次以ATR-FTIR OPF-聚吡咯复合材料在OPF定性显示聚吡咯的存在。图2显示了明显的峰值出现在OPF-聚吡咯材料OPF光谱中缺席。1550 cm-1的吸收带的特点是吡咯环骨架延伸和强大的吸收带出席750 cm-1是由于碳氢键延伸和重叠的年代延伸的磺酸盐阴离子发生从690-900 cm-1。此外，在1200 cm-1处的吸收带是由于C-N伸缩，和1030 cm-1处的C-H共振。
图2：OPF和OPF聚吡咯材料的红外光谱。重叠光谱显示骨骼C-C拉
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