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文献翻译
RGD肽修饰的石墨烯仿生传感器实时检测一氧化氮
摘要：一直以来，构建具有特殊理化性质的用于实时检测生物分子从活细胞释放的智能功能纳米结构都具有挑战性。我们在这儿公布一种新的方法，通过共价键合RGD肽在芘丁酸功能化的石墨烯薄膜表面建立一个独立的仿生传感器。传感器中的RGD肽提供的仿生性能优越人类细胞中附着和生长在薄膜表面的一氧化氮的实时检测器，尽管在药物的刺激下，这个生物分子很快地从内皮细胞中释放。该膜传感器具有良好的灵活性和稳定性，它除保留其原始每放松周期45次弯曲和高再现性，同时具有高灵敏度，良好的选择性，并对生命细胞释放的一氧化氮具有实时定量检测能力。这项研究不仅描述了制造智能纳米石墨烯功能膜的方法，而且也提供了一个实时研究分子从活细胞中释放的强大、可靠的平台，从而发现其在神经科学、筛选药物治疗的效果方面以及活细胞的检测中的潜在应用。
关键词：RGD肽，氧化石墨烯，功能化生物膜，活细胞检测，一氧化氮检测。
正文
实时检测分子从活细胞中释放对于了解细胞功能和病理学、以及疾病诊断和药物发现中具有重要意义。从活细胞中释放的各种分子中，一氧化氮是一种重要的生物信号分子，它在神经细胞功能调节、血管和免疫系统中起着重要的作用，如它可作为一种神经递质，用于调节血管舒张。另外，一氧化氮也会影响帕金森病以及血管肿瘤的形成。因此，实时检测活细胞释放的一氧化氮是十分重要的，它为临床诊断、生物研究和药物发现中提供生理和病理因素设立了一个平台。但是，活细胞释放的一氧化氮十分微量，以及其半衰期短，其实时检测是一个很大的难题。因此，构建一个智能的功能传感平台，实时捕获和检测释放的一氧化氮分子是非常具有挑战性的。
与一氧化氮的其他间接、复杂的检测技术如荧光探针、X-射线、光电子能谱以及反向高效液相色谱法相比，电化学传感具有直接简单的优点。在一氧化氮的电化学传感发展过程中，最近的研究主要聚焦于纳米材料，因为纳米材料具有高的比表面积，可以促进电子的转移。功能纳米材料如碳纳米管、碳纳米管、纳米金已在一氧化氮电化学传感器的探索中，显示出优越的性能。作为一种具有单原子层、大接触面积、高导电率和宽电化学窗口的优质碳材料，石墨烯在电化学传感器中用于广阔的应用前景。最近，我已经发现石墨烯可以灵敏地检测出缓冲溶液中的一氧化氮。尽管如此，实时检测从活细胞中释放的一氧化氮依然十分困难。最好的方法是使电极表面直接生长有生命的细胞，使其非常接近于传感器。因此，电极表面应具有优良的仿生性能以利于细胞的生长和粘附，这个非常复杂难控，且需要特殊的表面受体以供细胞生长与功能调节。
我们发现了一种新的方法，通过共价键结合在石墨烯表面连接上RGD肽构建一个智能化的仿生膜传感器，在药物刺激下可以显著促进细胞黏附和生长，用于实时检测活细胞释放的一氧化氮。选择RGD肽是因为其肽部分类似于细胞外基质的蛋白质序列，它也可以促进细胞膜的外表面的黏附性。功能化生物膜的制备在方案1中显示。氧化石墨烯可以还原为石墨烯，同时，芘丁酸功能化的氧化石墨烯具有芳香结构，可以通过pi;-pi;之间的相互作用吸附在石墨烯表面。芘丁酸功能化的石墨烯膜是通过过滤的芘丁酸功能化的氧化石墨烯溶液直接组装的方法制备，RGD肽与芘丁酸功能化氧化石墨烯通过EDC/NHS耦合连接。
结果讨论
石墨烯基生物膜的表征
图1a显示，RGD肽功能化的氧化石墨烯具有独立的结构，其中包括8um厚的填料层结构。生物膜的表面有波浪状的形态，从上方看，扫描电子显微镜（SEM）看到图是一维图像。用反射吸收红外光谱法研究不同石墨烯薄膜的表面性能（RA-IR），图1E 显示芘丁酸功能化的氧化石墨烯与RGD肽连接在1586cm-1有一个强的吸收峰，这是羧基的伸缩振动峰。相反，无芘丁酸功能化的氧化石墨烯在1586cm-1无明显的吸收峰。这些结果表明，用芘丁酸来修饰氧化石墨烯的方案是成功的。当RGD肽与芘丁酸功能化的氧化石墨烯共价结合后，导致生物膜上出现了1645cm-1和1533 cm-1两个新峰，分别对应RGD肽特征的酰胺I带和II带，其羧基在1586cm-1的吸收峰虽然变弱但依然可见。这些结果表明，RGD肽可以有效地结合在芘丁酸功能化的氧化石墨烯表面，生成的生物膜表面仍然具有羧基的结构。RGD肽在石墨烯生物膜中的分布用异硫氰酸荧光素混合异构体可以直观地显示，其对肽和蛋白质中的伯胺基团具有很高的活性。RGD肽功能化的石墨烯具有很强的荧光信号，其颜色也分布均匀，但是对照组的石墨烯薄膜没有RGD肽的连接，则不显示荧光反应，这可以验证RGD肽在石墨烯中的分布。值得注意的是，在其水溶液中，采用温和超声，氧化石墨烯可以很好地保持其完整的结构，具有很好的机械强度和测试解决方案为基础的操作能力。
RGD肽连接的氧化石墨烯的细胞黏附性的研究。用于实时检测从活细胞中释放的生物分子，传感矩阵的表面性能非常重要，这是因为细胞需要特定的表面受体用于附着和生长。如图2A所示，在纯石墨烯薄膜上的人脐静脉内皮细胞会生成一个长形的伪足，这种膜是一种生物相容性的平台，可以促进细胞的附着和生长。众所周知，细胞在培养基上的黏附和生长不仅仅取决于基板的表面性质，也和吸附在其表面培养基或从细胞分泌出的蛋白质的种类有关，这些有助于观察在纯石墨烯表面黏附和生长的细胞状况。细胞的黏附和生长能力因为RGD肽的共价结合明显地得到提高，有实验明确表明细胞密度增加了2倍以上，超过普通石墨烯表面细胞密度近50%以上。这是RGD肽的肽部分模仿细胞外基质蛋白的细胞结合序列的表现，可以理解为石墨烯薄膜的仿生性能大大促进了细胞粘附活性和细胞生长。
RGD肽共价键合的石墨烯膜生物传感器的电化学行为。RGD肽共价键键合的氧化石墨烯膜用于检测细胞培养基中的一氧化氮的溶解度，图3A给出了循环伏安法，其中生物膜在细胞培养液中无氮氧化物（曲线1）只表现出典型的电容行为，造成其双电层涵盖了全电压的范围（0至1 V与Ag / AgCl电极）。与之相反，含10mu;M一氧化氮的细胞培养基中的生物膜含有一个峰电位为750 mV的大的氧化峰，这表面一氧化氮具有良好的电化学氧化催化作用。在氧化过程中，一氧化氮分子根据化学转化失去一个电子从NO2变成NO 。其反应如下：
NO－e- → NO
NO OH-→HNO2→H NO2
双阶电位计时电流测定法是一种可以在异构化的溶液中获得高信噪比的可选择的电流响应（S / N）的电化学技术。因此，一氧化氮的浓度变化可以双阶电位计时电流法的双脉冲电位来检测。记录在细胞培养基中溶解的一氧化氮分子的典型双脉冲电位在图3b的插图所示，响应电流定义为第一电位之间的差异（650 mV，一氧化氮氧化的起始电位）和第二电位（750 mV，一氧化氮的氧化峰电位）。图3B中的电位对数图则反应了一氧化氮的浓度分布，显示与一氧化氮分子浓度在纳摩尔范围的增加相关的生物膜反应的两个线性区域，其检测限是氮比为3基础上的25纳米。有细胞培养物存在时，一氧化氮传感矩阵的响应值大约是1/30，没有细胞培养物时，其检测限为80纳米左右。通过调查亚硝酸盐，抗坏血酸，和各种离子的干扰物种，我们对一氧化氮分子的传感矩阵的选择性进行了研究。如图3C显示，RGD多肽接枝烯生物传感矩阵对一氧化氮分子的选择性好，可以消除这些物种包括亚硝酸盐具有类似的氧化电位对一氧化氮的干扰。传感矩阵的良好的选择性可能来自其保留表面的羧基（可以从图1E），其表面有负电荷，可以排斥带负电荷的亚硝酸钠和抗坏血酸。
RGD肽共价结合的石墨烯生物膜传感器的柔韧性和重现性。为了检测 RGD肽共价结合的石墨烯生物膜传感器的柔韧性和稳定性，我们利用弯曲和放松周期的反应进行了研究。如图4所示，该传感器在45个收缩舒展中期后，几乎可以保持原有的电流响应值，显示出了良好的灵活性和稳定性，这得利于石墨烯良好的机械稳定性以及层状生物膜的完整性。石墨烯生物膜良好的灵活性有利于体内一氧化氮生物传感器方面新的应用程序，以适应弯曲测量表面。该传感器也具有高度的重现性，这可以从测量15个电流响应值后都保持不变的现象中可以看出来。当前的响应值，在相对误差不超过7.6%的情况下，是相同工艺制备的生物膜的6倍。
实时检测从活细胞中释放的一氧化氮。在实时检测分子的过程中，一氧化氮分子的产生细胞和传感矩阵之间的距离是有效捕获和检测一氧化氮的一个关键因素，在一个有限的扩散距离内，细胞培养液中，分子总是会快速地代谢降解。自从在RGD肽共价结合的石墨烯生物膜表面培养出人类内皮细胞后，密切地接触就可以灵敏地检测出从活细胞中释放的一氧化氮分子。培养的人血管内皮细胞的生物膜是用来佐证从所附的细胞中释放出的一氧化氮分子的实时检测。其过程如图5A所示。乙酰胆碱（Ach），作为模型药物可以刺激一氧化氮的释放，乙酰胆碱到细胞中一氧化氮的产生的信号通路已经被发现。它可以使信号发生级联反应，信号通路通过一系列的细胞受体可以活化Ca2 通道，触发一氧化氮的产生以及释放。 L-精氨酸甲基酯（L-NAME），是一种一氧化氮抑制剂，可作为模型药物用于抑制一氧化氮的释放。值得注意的是，乙酰胆碱的增加（1毫米）或L-NAME（1毫米）到细胞培养液中不会在石墨烯膜表面引起任何显著的电流变化，这可以清楚地表明，乙酰胆碱和L-NAME没有电化学活性。
生长在氧化石墨烯共价键结合的RGD肽生物膜传感器的细胞对不同药物的动态响应的研究。DPSCA的响应值如图5B所示。而刺激药物和抑制药物的加入如箭头所示。1毫米和0.5毫米乙酰胆碱的刺激可以导致明显的电流反应，相反的是，在1毫米的乙酰胆碱和1毫米的L-NAME的混合液中并没有发生电流反应，这主要是由于L-NAME对一氧化氮释放的特异性抑制作用。乙酰胆碱对其的刺激作用主要与其浓度有关，刺激2分钟后，1毫米乙酰胆碱的刺激响应电流是0.5毫米乙酰胆碱的刺激响应电流的2倍。基于药物刺激电流的响应以及生物膜传感器的性能指标，一氧化氮的分子浓度分别为350nm和145nm时，分别用1mm以及0.5mm的乙酰胆碱药物浓度来刺激，这可以实时检测一氧化氮。据报道，从活的细菌细胞产生一氧化氮的浓度在纳摩尔范围，在这项工作中所研究的人类细胞释放的一氧化氮的浓度是在几百纳摩尔（145nm-350 nm）。迄今为止，人类细胞与细菌细胞释放一氧化氮的机制的不同人类研究并没有完全理解，虽然我们推测它可能是由于人类细胞的体积比细菌大得多，这是目前在我们的实验室正在研究中的。
总结
总之，我们验证了通过共价键合RGD肽对芘丁酸功能化的石墨烯生物膜表面构建一个智能仿生传感器面部的方法。RGD肽可以促进仿生生物膜在人体细胞的生长与附着。生物膜传感器经过收缩/放松周期，可以保留其原有的良好的灵活性和稳定性，以及从几乎不变的电流响应15个重复测量后显示出的高度的重现性，这显示出对一氧化氮检测的高的灵敏度和良好的选择性。生物膜传感器被进一步用于选择性检测在药物刺激后内皮细胞释放出的一氧化氮分子，这显示出其实时检测的能力。这项研究不仅研究制备出功能的氧化石墨烯的生物膜的方法，同时也提供了一个强大的平台来构建下一代生物医学设备，用于活细胞检测和药物治疗因素筛选。值得注意的是从电极上生长的细胞释放一氧化的电化学引号的影响因素需要进一步研究比较。此外，细胞可以继续在氧化石墨烯的生物膜上生长，并可同时监测时间密度以提供良好的条件来检测一氧化氮。
实验部分
- 芘丁酸功能化石墨烯
天然石墨粉加入浓H2SO4以及K2S2O8的混合液中，和P2O5以5:1:1的质量比例，在80摄氏度下加热6小时。然后在室温搅拌过夜后，将混合物用去离子水稀释和过滤，过滤后的粉体加入到硫酸（冰冷却）后搅拌15 min，在冰水浴的条件下将KMnO4缓慢加入到该混合物。将混合物加热到35摄氏度，保持6小时。然后在一个冰冷却环境慢慢用去离子水稀释，室温下反应2小时后，缓慢加入30%的过氧化氢，搅拌反应30分钟。用10%盐酸洗涤过滤然后离心。0.1mg/mL的氧化石墨烯水溶液超声剥离60分钟，制成氧化石墨烯的分散溶液，然后用芘丁酸功能化石墨烯。100毫克的氢氧化钠加入到100mL的氧化石墨烯中（0.1mg/mL），加入150毫克芘丁酸，混合物用水合肼在80摄氏度下还原过夜，分散离心得到上清液。
- RGD肽共价键合石墨烯膜
芘丁酸功能化的石墨烯分散是通过醋酸纤维素膜过滤（0.22mu;m孔径）生产的石墨烯薄膜，然后用去离子水反复洗涤，真空干燥。然后用EDC和NHS活化石墨烯2小时后，将RGD肽投料反应，然后用pH 7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，得到RGD肽共价键合的石墨烯膜。
- 细胞培养与操作
培养基制备混合MCDB 131培养基、碳酸钠、肝素、牛骨提取物，并在灭菌去离子水和胎牛血清过滤，人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养制备培养基度在加湿的孵化器。培养细胞对石墨烯薄膜，人脐静脉内皮细胞接种在5000厘米sim;细胞密度和允许留在37摄氏度在加湿的孵化器上生长的石墨烯生物膜被认为是0，132，189，225和241每平方毫米，可以发现，18小时后，细胞的生长速度变慢，这是选择的时间培养细胞的细胞传感研究
- 实时监测细胞释放一氧化氮分子
实时监测细胞释放的一氧化氮分子的装置的设置是相同的电化学测量，其直径为2毫米，而高度为20毫米，填充物为电解质。细胞一氧化氮的生产行为是采用双电位阶跃计时电流监测。在细胞释放的一氧化氮测量，细胞培养基中的设备是轻度搅拌，测得的一氧化
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